CRISPR-Cas9 基因編輯技術(shù)的廣泛應(yīng)用，推動(dòng)基因功能研究進(jìn)入高通量時(shí)代。然而，傳統(tǒng)單細(xì)胞 CRISPR 篩選技術(shù)存在細(xì)胞分離效率低、數(shù)據(jù)分析周期長(zhǎng)等問(wèn)題，限制了全基因組篩選的大規(guī)模開(kāi)展。Illumina 即將推出的高通量單細(xì)胞 CRISPR 制備技術(shù)，以 “粒子模板即時(shí)分區(qū)"（PIP）聚合物為核心，結(jié)合 NovaSeq X 測(cè)序儀與 DRAGEN 加速分析系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn) 100 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞反應(yīng)規(guī)模的高效篩選，為基因編輯研究帶來(lái)革命性突破。
PIP 聚合物技術(shù)是該系統(tǒng)的核心創(chuàng)新點(diǎn)。傳統(tǒng)單細(xì)胞分離多采用微流控芯片技術(shù)，存在細(xì)胞堵塞、分離效率低（約 60-70%）的問(wèn)題。PIP 聚合物通過(guò)特殊的多孔結(jié)構(gòu)，在微流控通道中形成獨(dú)立的 “粒子模板分區(qū)"，每個(gè)分區(qū)可精準(zhǔn)捕獲單個(gè)細(xì)胞，分離效率提升至 95% 以上。同時(shí)，PIP 聚合物表面修飾的特異性抗體，能與細(xì)胞表面標(biāo)志物結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定細(xì)胞亞群的富集，例如在免疫細(xì)胞 CRISPR 篩選中，可針對(duì)性分離 T 細(xì)胞、B 細(xì)胞等，提高篩選的精準(zhǔn)性。
在文庫(kù)構(gòu)建環(huán)節(jié)，該技術(shù)采用 “原位逆轉(zhuǎn)錄" 策略，將 CRISPR 向?qū)?RNA（gRNA）與細(xì)胞 mRNA 的捕獲、逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程整合在同一分區(qū)內(nèi)，減少樣本損失。傳統(tǒng)文庫(kù)構(gòu)建需經(jīng)過(guò)多步轉(zhuǎn)移操作，樣本損失率可達(dá) 30-40%，而原位逆轉(zhuǎn)錄技術(shù)將損失率控制在 5% 以下，尤其適合稀有細(xì)胞樣本的篩選。此外，系統(tǒng)配備的 “gRNA 條形碼標(biāo)記" 功能，為每個(gè) gRNA 添加條形碼，可同時(shí)追蹤 10 萬(wàn)個(gè)以上的 gRNA 靶點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模基因編輯效果的平行分析。
測(cè)序與數(shù)據(jù)分析環(huán)節(jié)的協(xié)同優(yōu)化，進(jìn)一步提升篩選效率。NovaSeq X 測(cè)序儀的高通量特性，可在 24 小時(shí)內(nèi)完成 100 萬(wàn)個(gè)細(xì)胞樣本的測(cè)序，產(chǎn)生約 500Gb 的原始數(shù)據(jù)。DRAGEN 加速分析系統(tǒng)則通過(guò)硬件加速與算法優(yōu)化，將 gRNA 定位、基因編輯效率計(jì)算等分析步驟的時(shí)間縮短至 8 小時(shí)，相較于傳統(tǒng)生物信息學(xué)分析流程（約 48 小時(shí)），效率提升 5 倍。同時(shí)，DRAGEN 系統(tǒng)內(nèi)置的 “脫靶效應(yīng)分析" 模塊，可通過(guò)比對(duì)參考基因組，檢測(cè) CRISPR 編輯過(guò)程中可能出現(xiàn)的脫靶位點(diǎn)，為基因編輯的安全性評(píng)估提供依據(jù)。
目前，該技術(shù)已在腫瘤耐藥基因篩選、信號(hào)通路解析等領(lǐng)域展開(kāi)驗(yàn)證。在腫瘤研究中，科研人員通過(guò)對(duì) 100 萬(wàn)個(gè)癌細(xì)胞進(jìn)行 CRISPR 篩選，成功鑒定出 30 余個(gè)與化療耐藥相關(guān)的基因，為開(kāi)發(fā)逆轉(zhuǎn)耐藥的靶向藥物提供靶點(diǎn)；在干細(xì)胞研究中，該技術(shù)助力解析多能性維持相關(guān)基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為干細(xì)胞定向分化提供新策略。隨著技術(shù)的成熟，Illumina 高通量單細(xì)胞 CRISPR 制備技術(shù)有望成為基因功能研究的常規(guī)工具，推動(dòng)基因編輯從 “靶向編輯" 向 “全景篩選" 邁進(jìn)。
關(guān)鍵詞：Illumina 單細(xì)胞 CRISPR PIP 聚合物 DRAGEN 加速分析 全基因組篩選
地址：上海市奉賢區(qū)金大公路8218號(hào)1幢
郵箱：1006909781@qq.com
傳真：QQ1006909781
當(dāng)前位置：